Preparación del tampón PCR con sulfato de amonio
Esta guía describe la preparación de un tampón de PCR con sulfato de amonio a una molaridad definida para uso en laboratorio.
El tampón de PCR con sulfato de amonio se utiliza habitualmente para aumentar la especificidad de los cebadores y optimizar la actividad de la ADN polimerasa.
Tampón de PCR con sulfato de amonio – Composición
| Nombre | Fórmula | Concentración | CAS |
|---|---|---|---|
| Sulfato de amonio | (NH₄)₂SO₄ | 20 mM | 7783-20-2 |
| Tris-Cl (pH 8.8) | C₄H₁₁NO₃ | 75 mM | 77-86-1 |
| Cloruro de magnesio | MgCl₂ | 2 mM | 7791-18-6 |
| Triton X-100 | C₃₄H₆₂O₁₁ | 0.1% (w/v) | 9002-93-1 |
Esterilización y almacenamiento
- Esterilización: filtración de 0.22 μm.
- Almacenamiento: dividir en alícuotas y almacenar a −20 °C.
Consejos
- El pH del tampón suele ser de 8.0–9.5, ajustado con Tris-Cl.
- Triton X-100 es muy viscoso; utilizar una solución madre de baja concentración o sustituirlo por Tween 20.
- Cuando se utiliza sulfato de amonio, la concentración de MgCl₂ suele ser mayor (2.0 ± 0.5 mM).
- NH₄⁺ y Mg²⁺ presentan efectos antagónicos; los tampones con sulfato de amonio muestran mayor especificidad de los cebadores en distintos intervalos de concentración de Mg²⁺.
- Los iones amonio desestabilizan los enlaces de hidrógeno entre cebador y molde con apareamientos incorrectos, aumentando la especificidad de la reacción.
- El tampón de PCR óptimo depende del tipo de ADN polimerasa; seguir las recomendaciones del proveedor.
- El uso directo de MgCl₂ anhidro es exotérmico; añadir en pequeñas porciones a una parte del volumen de disolvente.
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